熒光原位雜交技(fish)原理:是利用熒光標記的特異核酸探針與細胞內相應的靶DNA分子或RNA分子雜交,通過在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號,來確定與特異探針雜交后被染色的細胞或細胞器的形態(tài)和分布,或者是結合了熒光探針的DNA區(qū)域或RNA分子在染色體或其他細胞器中的定位。
熒光原位雜交技(fish)實驗步驟:
1、組織固定:組織取出洗凈后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。
2、脫水:組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟,包埋。
3、切片:石蠟經(jīng)切片機切片,攤片機撈片,62°烤箱烤片2h。
4、石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲1苯Ⅰ 15min-二甲1苯Ⅱ 15min-無水乙醇Ⅰ 5min-無水乙醇Ⅱ 5min,風干,DEPC水浸泡。
5、消化:根據(jù)組織固定時間長短,切片于修復液中煮沸10分鐘,自然冷卻。后基因筆畫圈,根據(jù)不同組織不同指標特性,滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。
意義
在研究DNA分子原理的基礎上發(fā)展起來的一種技術。其基本原理是兩條核苷酸單鏈片段,在適宜的條件下,能過氫鍵結合,形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 雙鍵分子的特點,應用帶有標記的(有性同位素,如3H、35S、32P、熒光素生物素、等非性物質)DNA或RNA片段作為核酸探針,與組織切片或細胞內待測核酸(RNA或DNA)片段進行雜交,然后可用自顯影等方法予以顯示,在光鏡或電鏡下觀察目的 mRNA或DNA 的存在并定位;用原位雜交技術,可在原位研究細胞合成某種多肽或蛋白質的基因表達。此方法有很高的敏感性和特異性,可進一步從分子水平來探討細胞的功能表達及其調節(jié)機制。已成為當今細胞生物學、分子生物學研究的重要手段。
原位雜交的應用范圍:
①細胞特異性mRNA轉錄的定位,可用于基因圖譜,基因表達和基因組進化的研究;
②感1染組織中病毒DNA/RNA的檢測和定位,如EB病毒mRNA、人類乳1頭狀瘤1病毒和巨細胞病毒DNA的檢測;
③癌基因、抑癌基因及各種功能基因在轉錄水平的表達及其變化的檢測;
④基因在染色體上的定位;
⑤檢測染色體的變化,分子病理技術服務,如染色體數(shù)量異常和染色體易位等;
⑥分裂間期細胞遺傳學的研究,如遺傳病的產(chǎn)前診斷和某些遺傳病基因攜帶者的確定,某些腫1瘤的診斷和生物學劑量測定等。
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